作為新一代RNA原位雜交技術(shù)的代表，美國(guó)Bio-Techne旗下的Advanced Cell Diagnostics（ACD）品牌研發(fā)的RNA原位雜交檢測(cè)技術(shù)，包括RNAscope，Basescope，miRNAscope已涵蓋了對(duì)所有RNA（長(zhǎng)度大于300nt的長(zhǎng)鏈RNA、50-300nt的RNA片段、外顯子跳躍的RNA、環(huán)狀RNA、以及17-50nt的小RNA，例如miRNA、siRNA、ASO等）的原位檢測(cè)。

在腫瘤、神經(jīng)、代謝等領(lǐng)域，非編碼小RNA作為一類(lèi)調(diào)節(jié)性RNA分子，越來(lái)越多受到研究人員的關(guān)注，它們?cè)谝恍┘膊〉陌l(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能具有關(guān)鍵性作用。同時(shí)，由于小RNA分子作為一類(lèi)基因表達(dá)調(diào)節(jié)性因子，在基因治療領(lǐng)域也具有很大潛力。針對(duì)于miRNA、siRNA、ASO等這類(lèi)分子的原位檢測(cè)，可以使用miRNAscope實(shí)現(xiàn)，但同時(shí)檢測(cè)調(diào)節(jié)性分子以及被調(diào)節(jié)的靶標(biāo)RNA分子表達(dá)變化，也具有非常廣泛的需求。為此，ACD日前推出了RNAscope Plus技術(shù)，將對(duì)小RNA的檢測(cè)和mRNA的檢測(cè)結(jié)合起來(lái)，可以實(shí)現(xiàn)同一張切片上同時(shí)對(duì)1個(gè)miRNA/siRNA/ASO和最多3個(gè)mRNA分子進(jìn)行熒光檢測(cè)。

RNAscope Plus結(jié)合了miRNAscope和RNAscope分別的探針設(shè)計(jì)以及信號(hào)放大系統(tǒng)，可對(duì)已有的小RNA及mRNA探針兼容。對(duì)mRNA檢測(cè)部分依舊采用“雙Z型探針“及信號(hào)放大，增加小RNA分子檢測(cè)后，不影響mRNA的信號(hào)。對(duì)小RNA的檢測(cè)，采用鏈狀探針及信號(hào)放大，可針對(duì)siRNA、ASO序列進(jìn)行個(gè)性化探針設(shè)計(jì)。成像后依舊可利用分析軟件對(duì)mRNA信號(hào)進(jìn)行定量分析。

得益于ACD專(zhuān)利的探針設(shè)計(jì)及信號(hào)放大技術(shù)，小RNA分子及mRNA分子的信號(hào)最終都可獲得高信噪比。下圖展示在細(xì)胞片中對(duì)miR-205和3個(gè)mRNA的陽(yáng)性對(duì)照探針及陰性對(duì)照探針的檢測(cè)。陽(yáng)性對(duì)照中各個(gè)通道上的信號(hào)點(diǎn)清晰，陰性對(duì)照中全片非常干凈，體現(xiàn)出方法的高特異性。

在小鼠腦組織切片的檢測(cè)中，也可獲得理想的結(jié)果。SNORD85可在小鼠腦某些細(xì)胞中特異性表達(dá)，下圖中除了對(duì)SNORD85進(jìn)行檢測(cè)外，也對(duì)小鼠的神經(jīng)元（Rbfox3）、星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP）、小膠質(zhì)細(xì)胞（Aif1）同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，可見(jiàn)不同靶標(biāo)特異的定位特征。

針對(duì)同一個(gè)miR-205分子，對(duì)比使用RNAscope Plus的熒光信號(hào)與使用可見(jiàn)光試劑盒miRNAscope的可見(jiàn)光紅染信號(hào)，二者對(duì)于miR-205不同表達(dá)豐度的細(xì)胞中小RNA分子的檢出結(jié)果有較高的一致性，證明不同的顯色方式對(duì)于靶標(biāo)的檢測(cè)沒(méi)有影響。

RNAscope技術(shù)是由Bio-Techne旗下Advanced Cell Diagnostics (ACD)品牌研發(fā)的RNA原位雜交產(chǎn)品，在近年來(lái)的生物檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)展迅速。與傳統(tǒng)的RNA原位雜交相比，RNAscope技術(shù)屬于新一代RNA原位雜交技術(shù)，其特異性的雙Z探針設(shè)計(jì)避免了傳統(tǒng)長(zhǎng)鏈RNA探針的弊端，配以自身級(jí)聯(lián)放大檢測(cè)原理，可以高效敏感地檢測(cè)到目標(biāo)RNA。該方法的具體優(yōu)勢(shì)如下：

應(yīng)用廣泛

使用RNAscope技術(shù)，靶點(diǎn)RNA為大于等于300個(gè)堿基的特異序列，即可進(jìn)行探針設(shè)計(jì)。因而RNAscope技術(shù)可以應(yīng)用于幾乎所有物種，所有組織以及所有基因的檢測(cè)。

特異性強(qiáng)

RNAscope獨(dú)特的雙Z（ZZ） 探針設(shè)計(jì)有效的防止了探針的非特異性結(jié)合，同時(shí)降低了背景干擾。由于結(jié)合在非特異性位點(diǎn)的單個(gè)的Z 探針不會(huì)產(chǎn)生完整的信號(hào)放大分子結(jié)合位點(diǎn)，并會(huì)在雜交過(guò)程中被洗脫掉，從而防止非特異性信號(hào)的放大，使得探針的信號(hào)具有高度特異性。探針設(shè)計(jì)合成需要2~4周時(shí)間即可完成。

靈敏度高

RNAscope方法檢測(cè)每個(gè)RNA 分子時(shí)，只需三對(duì)雙Z（ZZ）探針即可完成雜交和信號(hào)的可視化。

單分子可視化和單細(xì)胞定量

使用RNAscope技術(shù)雜交上三對(duì)及以上雙Z 探針即可在標(biāo)準(zhǔn)的顯微鏡下呈現(xiàn)可觀察到的點(diǎn)狀信號(hào)。ACD公司提供的分析軟件更可以定量每一個(gè)單細(xì)胞內(nèi)RNA 的表達(dá)水平。

兼容降解的RNA

由于RNAscope三對(duì)雙Z探針即可檢測(cè)到目標(biāo)RNA，而通常針對(duì)靶點(diǎn)RNA設(shè)計(jì)的探針為20對(duì)雙Z 探針，因而即使目標(biāo)RNA發(fā)生部分降解，仍可以穩(wěn)定有效地檢測(cè)到靶點(diǎn)RNA。

檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定一致性

RNAscope技術(shù)用到的探針以及所有檢測(cè)試劑全部由工業(yè)化合成，且該技術(shù)針對(duì)不同樣本類(lèi)型（冰凍切片， 石蠟切片，懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞等）已經(jīng)有成熟的實(shí)驗(yàn)操作流程，故使得RNAscope技術(shù)檢測(cè)結(jié)果具有穩(wěn)定性和一致性。除了可以在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行手工操作外，該產(chǎn)品也可以在Leica以及羅氏Ventana自動(dòng)平臺(tái)上運(yùn)行，為結(jié)果的一致性和穩(wěn)定性提供了可靠的依據(jù)。

多通道多靶點(diǎn)同時(shí)檢測(cè)

由于RNAscope技術(shù)可以同時(shí)進(jìn)行多通道探針雜交以及信號(hào)放大，故在可見(jiàn)光檢測(cè)中可以在同一張切片上同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)靶點(diǎn)；而在熒光檢測(cè)過(guò)程中，可以在同一張切片上檢測(cè)三個(gè)或三個(gè)以上靶點(diǎn)RNA。

在RNAscope技術(shù)的基礎(chǔ)上，ACD品牌旗下的Basescope技術(shù)可以檢測(cè)RNA水平的外顯子跳躍，點(diǎn)突變，環(huán)狀RNA等；miRNAscope可以原位對(duì)小RNA，包括miRNA, siRNA, ASO進(jìn)行追蹤定位；而近年來(lái)推出的RNAscope HiPlex技術(shù)則可以在一張石蠟切片上同時(shí)檢測(cè)最多12個(gè)RNA靶標(biāo)的分布定位，成為神經(jīng)科學(xué)，腫瘤微環(huán)境研究以及單細(xì)胞測(cè)序后驗(yàn)證等領(lǐng)域的常用檢測(cè)方法。